ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 30932019 肝吸虫囊蚴检测 荧光定量 PCR法 etection method of real time quantitative PCR for Clonorchis sinensis metacercaria 2019-12-25发布 2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 30932019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、宫鹏涛、郭衍冰、董航、苑淑贤、姚新华、程荣华、邵洪泽、程敏、李文东、李金龙、赵玉龙。DB22/T 30932019 1 肝吸虫囊蚴检测 荧光定量PCR 法 1 范围 本标准规定了肝吸虫囊蚴荧光定量PCR检测方法的技术要求。本标准适用于肝吸虫囊蚴的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。SYBR Green I：一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（SYBR Green Ndcleic Acid Gel Stains）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）Ct值：循环阈值（Cycle threshold）4 原理 根据肝吸虫囊蚴基因特定的序列设计合成一对特异性引物，在反应体系中SYBR Green I 与双链 DNA 结合发出荧光，通过检测 PCR 反应液中的荧光信号强弱，实现对目的基因的准确定量。随着 PCR 反应的循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试验条件 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应符合GB 19489的规定执行。5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。6 试剂和材料 DB22/T 30932019 2 6.1 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。6.1.1 动物组织基因提取试剂盒。6.1.2 阳性对照，为肝吸虫囊蚴 DNA，或含有附录 A.3序列的质粒 DNA。6.1.3 阴性对照，为 ddH2O。6.1.4 SYBR Green qPCR Master Mix（2）。6.1.5 ROX Reference Dye（50）。6.2 耗材 6.2.1 荧光定量 PCR 反应管。6.2.2 离心管，1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL。6.2.3 吸头，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L。6.3 引物 上游引物 P1：5-TCTGGGTAGGGTGGTTTGA-3 下游引物 P2：5-ATAGACGCTCCCGAGTTCC-3 使用时配制成10 mol/L工作液，置-20 保存，6 个月内使用。7 仪器 7.1 分析天平，感量 0.1 g。7.2 研钵。7.3 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。7.4 荧光定量 PCR 仪。7.5 高压蒸汽灭菌器。7.6 微量移液器，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L。7.7 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100。7.8 冰箱，-20 2。8 样品 采集不少于500 mg（7.1）肝吸虫囊蚴宿主的肌肉，避免污染。样品应-20 保存，冷藏运输，不能在24 h内送达实验室的样品应冷冻状态运送。9 操作步骤 9.1 模板的制备 样品研磨均匀（7.2），采用动物组织基因提取试剂盒（6.1.1）提取待检样品、阳性对照（6.1.2）、阴性对照（6.1.3）DNA作为模板，操作方法按说明书进行。9.2 反应体系 DB22/T 30932019 3 采用25 L反应体系，在荧光定量PCR反应管（6.2.1）中依次加入表 1所示的试剂后，盖紧管盖，瞬时离心混匀（7.3），避免产生气泡，做好标记，置于荧光定量PCR仪（7.4）中扩增。表1 荧光定量 PCR 反应体系 成分 用量/L SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 P1 1.5 P2 1.5 ROX Reference Dye 0.5 DNA 模板 2.0 ddH2O 7.0 总计 25.0 9.3 反应程序 第一阶段，95预变性 5min；第二阶段，95变性 5 s，57 退火30 s，40 个循环。在第二阶段57 退火30 s处设置收集荧光信号，观察扩增曲线。10 结果判定 10.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。10.2 质控标准 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。10.2.2 阳性对照的 Ct 值应30，并出现典型的扩增曲线。10.2.3 阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件则实验视为无效。10.3 结果描述及判定 10.3.1 阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无肝吸虫囊蚴核酸。10.3.2 阳性判定 Ct值35，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在肝吸虫囊蚴核酸。35Ct值40，应进行重复试验。如果重复试验的Ct值40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。_