ICS 65.150 B 50 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 866 2019 水和沉积 物中孔雀 石绿及其 代谢物残 留量的测定 液 相色谱-串 联质谱法 Determination of malachite green and its metabolite residues in water and sediment by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2019-01-14 发布 2019-02-15 实施 天津 市 市 场 监 督 管 理 委 员 会 发布 DB12/T 8662019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本 标准 由天 津市 渔业 发展 服务中 心 提 出并 归口。本 标准 起草 单位：农 业农村 部渔 业环 境及 水产 品质 量监督 检验 测试 中心（天 津）。本 标准 主要 起草 人：陈永 平、李 春青、时 文博、高 丽娜、李宝 华。DB12/T 8662019 1 水 和沉积 物中孔雀 石绿及 其代谢物 残留量 的测定 液 相色谱-串 联质谱法 1 范围 本标准 规定 了水 质及 沉积 物中孔 雀石 绿和 无色 孔雀 石绿残 留量 测定 的试 剂、仪器设 备、测定 步 骤、计算、方法 灵敏 度、方法 回收率、方 法精 密度。本标准 适用 于水和 沉 积物 中孔雀 石绿 和无 色孔 雀石 绿残留 量检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 沉积物 中孔 雀石绿(Malachite Green MG)及其 代谢 物 无色孔 雀石 绿（Leucomalachite Green LMG）残留提取，利用N，N，N，N-四 甲基对 苯二胺(2,3,5,6-tetramethyl-1,4-phenylenediamine TMPD)解吸附 后，二氯 甲烷 萃取。水中孔 雀石 绿和 无色 孔雀 石绿二 氯甲 烷提 取，质谱 检测器 检测，内 标法 定 量。4 试剂 4.1 孔雀石 绿及 无色 孔雀 石绿 标准品：孔 雀石 绿纯 度98%，无色 孔雀 石绿 纯度 98%。4.2 乙腈：色谱 纯。4.3 甲醇：色谱 纯。4.4 二氯甲 烷。4.5 实验用 水符 合GB/T 6682 一级水 指标 4.6 2.0 mmoL L-1乙 酸铵 缓 冲 溶 液：称 取0.077 g 无 水乙 酸铵溶 解于 适量 水中，再 加入 0.5 mL 甲酸，再加水 定容 至500 mL。4.7 TMPD 溶液(1.0 mg mL-1)：称取50 mg N，N，N，N-四甲 基对 苯二 胺（TMPD）溶于 50 mL 甲醇中。4.8 孔雀石 绿（MG）、无 色孔 雀石 绿(LMG)标 准储 备液（100 g mL-1）：准确 称取 适 量的孔 雀石 绿、无色孔雀 石绿 标准 品，分别 用乙腈 溶解 并定 容，于-18 避 光保 存，可使 用1 年。4.9 氘代孔 雀石 绿（MG-D5）和 氘代无 色孔 雀石 绿（LMG-D6）内 标标 准储 备液（100 g mL-1）：准确 称取适量 的氘 代 孔 雀石 绿和 氘代无 色孔 雀石 绿标 准品，分 别用 乙腈 溶解 并定 容，于-18 避 光保 存，可使用1 年。4.10 混合外标 标 准中 间液（1.0 g mL-1）：分别 准确 吸取1.0 mL 孔 雀石 绿 和 无色 孔 雀石绿 的标 准储备液（4.7）于100 mL 容 量瓶中，用 乙腈 稀释 定容，于-18 避光 保存，可 使用 6 个月。DB12/T 8662019 2 4.11 混合内 标标 准中 间液（1.0 g mL-1）：分别 准确 吸取1.0 mL 氘代 孔 雀石 绿和 氘 代 无色 孔雀 石绿标准储 备液（4.8）于100 mL 容 量瓶 中，用乙 腈稀 释定容，于-18 避 光保 存，可使用 6 个 月。4.12 混合外 标标 准使 用液（0.10 g mL-1）：准确 吸 取 1.00 mL 混合 外标 标 准中 间液（4.9）于 10.0 mL容量瓶 中，用乙 腈稀 释定 容，于-18 避 光保 存，可使 用1 个 月。4.13 混合内 标标 准使 用液（0.10 g mL-1）：准 确吸 取 1.00 mL 混合 内标 标准 中间 液（4.10）于10.0 mL 容 量瓶 中，用乙 腈稀 释 定容，于-18 避光 保存，可使 用1 个月。4.14 混合标 准工 作液：临 用时 准确吸 取 相 应体 积 的 混合 外标标 准使 用液（4.11），再加入 混合 内 标 标准使用 液（4.12）20 L，用乙腈 和2.0 mmoL L-1乙 酸铵缓 冲溶 液（1:1，V/V）稀释 定容 至 1 mL，标 准曲线系 列浓 度分 别 为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 ng mL-1，现 用现 配。注：除特殊注明外，所有试剂均为分析纯。5 仪器和 设备 5.1 液相色 谱-串联 质谱 仪：配 有电喷 雾（ESI）离 子源。5.2 电子天 平：感 量1.0 mg 和0.01 mg。5.3 高速冷 冻离 心机：可 制冷 到 4（最大 转速 高于 10 000 r/min）。5.4 超声波 震荡 仪。5.5 涡旋振 荡器。5.6 移液器(10 L，20 L，50 L，100 L，1000 L)。5.7 旋 转蒸 发仪。5.8 纯水 器。5.9 冰箱：具 有4 冷 藏箱 和 达到-18 以下 冷冻 箱。6 测定步 骤 6.1 样品制 备 6.1.1 水：将 采集 水样 过 0.45 m 滤膜，收 集水 样体 积 1 L，于4 冰箱 保存，6 d 内测定。6.1.2 沉积物：将 沉积 物置 于阴 凉处风 干，研磨 过筛（150 目），收 集沉 积物 质量20 g，于 4 冰箱保存，6 d 内测 定。6.2 样品处 理 6.2.1 水：量 取水样 500 mL，置 于分液 漏斗 中，加 入 40 L 混合 内标 标准 使用 液（4.12），再 加入30 mL 的 二氯 甲烷，振 摇5 min，静 置30 min，取 下层 二氯甲 烷于 锥形 瓶 中，再 加入 30 mL 二氯 甲烷 重复一次，若分 层不 明显，取 其 下层 液 于50 mL 离 心管 中，冷 冻离 心 机6000 r/min 离心 3 min，再取 下层液，合 并于 锥形 瓶 中，旋 转蒸发 温 度 30，旋转 蒸发浓 缩 至 近干，残 留物 加入 2.0 mL 的 乙腈-2 mmoL L-1乙 酸铵 溶液(11，V/V)（4.5），涡 旋振 荡 1 min，超声 波振 荡2 min，过 0.22 m 有机 相滤膜后，上机 测定。6.2.2 沉积物：称取 粉 末状 沉积 物样品(5.0 0.01)g 于 50 mL 聚乙 烯离 心管 中，先 加入 200 L TMPD溶液（4.6），再加入 40 L 混合 内标 标准 使用 液（4.12），加 入20 mL 二氯 甲烷，涡 旋 2 min，超声波震 荡25 min，6000 r/min 离心 5 min，取上 层液 于 锥形 瓶 中，再 向离 心管 中加 入 20 mL 二 氯甲 烷，重复上 述操 作，合并 上清 液 锥形 瓶 中，旋 转蒸 发温 度30，旋转 蒸发 浓缩 至 近干，残留 物加 入2.0 mLDB12/T 8662019 3 的乙腈-2 mmoL L-1乙酸铵 溶液(1 1，V/V)（4.5），涡旋 振 荡1 min，超声 波振 荡 2 min，过 0.22 m有机相 滤膜 后，上机 测定。6.3 标准工 作曲 线制 作 分别准确移取100 ng mL-1混合外标标准使用 液（4.11），乙腈稀释至0.50 ng mL-1、1.0 ng mL-1、2.0 ng mL-1、5.0 ng mL-1、10.0 ng mL-1、20.0 ng mL-1混 合标准 工作液，内标液 浓度均为2 ng mL-1，供液相色 谱-串联 质谱 仪测 定。6.4 测定 6.4.1 色谱条 件 色谱柱：C8 柱，2.2 m，75 mm2.1 mm（内 径），或相当。柱温：35。样品室 温度：15。流动相A：含0.1%甲 酸的2.0 mmoL L-1的 乙酸 铵水 溶液；流动 相B：0.1%甲酸-乙 腈溶液；进 样体 积：5.0 L；具 体参 数见 表1。流速：0.25 mL min-1。表1 流动相 梯度 洗脱 程序 时间（min）A/%B/%0.1 30 70 2 30 70 7 2 98 9 2 98 9.01 30 70 11 30 70 6.4.2 质谱条 件 离子化 模式：电 喷雾 离子 源（ESI），正 离子 模式。离子源 温度：600。气帘气：25；碰 撞气：中；喷雾 电压：5000 v；辅 气1：60；辅气2：40。扫描模 式：多反 应监 测（MRM，反 应监 测母 离子、子 离子、锥孔 电压 和碰 撞能 量见 表2。表2 目标化 合物 质谱 条件 目标 化合物 母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压(v)碰撞能量(ev)MG 329 208 120 38 313*120 38 LMG 331.1 316.1*120 20 239.1 120 30 D5-MG 334.1 318.1 120 40 D6-LMG 337.1 322.1 110 22 注：*为定量碎片离子 DB12/T 8662019 4 6.5 定性依 据 在同样 测试 条件 下，阳 性 样品保 留时 间与 标准 物质 保留时 间相 对偏 差在5%以 内，且检 测到 的离 子的相对 丰度，应 当与 浓度 相当的 校正 标准 品相 对丰 度一致。次 强 碎 片离 子丰 度与定 量离 子丰 度 比 应 符 合表3要 求。空白 样品、标 准 溶液及 添加 样品 的离 子流 图 参 见 附录A 附录E。表3 基峰与 次强 碎片 离子 丰度 比要求 次强碎片离子相对丰度（%）允许相对偏差(%)50 20 20 50 25 10 20 30 10 50 6.6 定量测 定 定量离 子采 用丰 度最 大的 二级特 征离 子碎 片 符 合表2 的要求。6.7 空白试 验 除不加 试祥 外，均按 上述 测定条 件和 步骤 进行。7 计算 7.1 用仪器 自带 工作 站 按 内标 法进行 自动 计算，以 化合 物上机 响应 的峰 面积 与内 标物峰 面积 比值 为纵坐标、化 合物 浓度 与内 标 物浓度 比值 为横 坐标，绘 制标准 曲线，再根 据样 品 的峰面 积响 应值 与内 标物 峰面积比 值，利用 标准 曲线，得到 样品 制备 液的 实际 测定浓 度。7.2 水 样品 中 孔 雀石 绿及 其代 谢物 残 留量 按式（1）计 算。计算 结果 须 扣 除空 白值。.(1)式中：X 试样 中目 标物 含量，单位 为微 克每 升（g L-1）；C 试样 溶液 中目 标物 含量，单位 为纳 克每 毫升（ng mL-1）；V 试样 体积，单 位为 毫升（mL）；v1 试样 定容 体积，单 位为毫 升（mL）。7.3 沉积物 样品 中 孔 雀石 绿及 其代谢 物 残 留量 按式（2）计算。计算 结果 须 扣 除空 白值。.(2)式中：X 试样 中目 标物 含量，单位 为微 克每 千克（g kg-1）；C 试样 溶液 中目 标物 含量，单位 为纳 克每 毫升（ng mL-1）；m 试样 质量，单 位为 克（g）；v1 试样 定容 体积，单 位为毫 升（mL）。DB12/T 8662019 5 8 方法灵 敏度 8.1 水质中 孔雀 石 绿 及其 代谢 物(无 色孔 雀石 绿)的 定量 限 均为 4 ng L-1。8.2 沉积物 中孔 雀石 绿及 其代 谢物(无色 孔雀 石绿)的定 量限均 为 0.4 g kg-1。9 方法回 收率 9.1 水质中 添加 浓度 为 4 ng L-1100 ng L-1 时 回收 率为 70%110%。9.2 沉积物 中 添 加浓 度为 0.4 g kg-110 g kg-1 时回 收率 为70%110%。10 方法精 密度 本方法 的批 内相 对标 准偏 差小于10%，批 间相 对标 准 偏差小 于15%。DB12/T 8662019 6 A A 附 录 A（资料 性附 录）空白沉 积物 特征 离子 色谱 图 XIC of+MRM(6 pairs):329.300/313.100 Da ID:MG-313 from Sample 2(BLANK)of DataSET1.wiff(Turbo.Max.533.0 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0500I.3.025.415.537.40 6.577.63 6.65 7.135.943.964.054.613.05 2.052.77 1.70 1.30 3.660.600.37XIC of+MRM(6 pairs):334.300/318.200 Da ID:MG-D from Sample 2(BLANK)of DataSET1.wiff(Turbo S.Max.1.3e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.001.00e5I.4.046.754.20XIC of+MRM(6 pairs):331.300/316.300 Da ID:LMG-316 from Sample 2(BLANK)of DataSET1.wiff(Turb.Max.333.0 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0333I.7.88 7.186.016.116.85 4.51 5.32 3.654.702.885.512.077.59 7.323.521.55 4.162.18 6.39 0.440.190.66 0.93 1.39XIC of+MRM(6 pairs):337.300/322.300 Da ID:LMG-D from Sample 2(BLANK)of DataSET1.wiff(Turbo.Max.4.3e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.04.3e5I.6.755.37 7.047.22 DB12/T 8662019 7 B B 附 录 B（资料 性附 录）孔雀石 绿及 其代 谢物 混合 标准特 征离 子色 谱图（10 ng mL-1）XIC of+MRM(6 pairs):329.300/313.100 Da ID:MG-313 from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Spr.Max.1.7e6 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e61.7e6I.4.216.81XIC of+MRM(6 pairs):334.300/318.200 Da ID:MG-D from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Spray.Max.1.6e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e51.6e5I.4.216.78XIC of+MRM(6 pairs):331.300/316.300 Da ID:LMG-316 from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Sp.Max.1.5e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e51.5e5I.6.804.21XIC of+MRM(6 pairs):337.300/322.300 Da ID:LMG-D from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Spra.Max.4.0e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.04.0e5I.6.776.955.417.34 DB12/T 8662019 8 C C 附 录 C（资料 性附 录）沉积物 加标 特征 离子 色谱 图（2.0 gk g-1）XIC of+MRM(6 pairs):329.300/313.100 Da ID:MG-313 from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Spr.Max.1.7e6 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e61.7e6I.4.216.81XIC of+MRM(6 pairs):334.300/318.200 Da ID:MG-D from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Spray.Max.1.6e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e51.6e5I.4.216.78XIC of+MRM(6 pairs):331.300/316.300 Da ID:LMG-316 from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Sp.Max.1.5e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e51.5e5I.6.804.21XIC of+MRM(6 pairs):337.300/322.300 Da ID:LMG-D from Sample 7(10)of DataSET1.wiff(Turbo Spra.Max.4.0e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.04.0e5I.6.776.955.417.34 DB12/T 8662019 9 D D 附 录 D（资料 性附 录）空白水 质特 征离 子色 谱图 XIC of+MRM(6 pairs):329.300/313.100 Da ID:MG-313 from Sample 23(BLANK)of DataSET1.wiff(Tur.Max.2300.0 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min02000I.4.256.86 6.29 7.645.84 7.32 5.244.35 5.69 5.074.050.17 3.113.933.171.31 0.481.052.08 2.362.461.59XIC of+MRM(6 pairs):334.300/318.200 Da ID:MG-D from Sample 23(BLANK)of DataSET1.wiff(Turbo.Max.1.7e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e51.7e5I.4.246.77XIC of+MRM(6 pairs):331.300/316.300 Da ID:LMG-316 from Sample 23(BLANK)of DataSET1.wiff(Tur.Max.400.0 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0400I.5.397.446.815.25 4.515.61 4.576.446.27 7.337.97 3.864.093.56 1.243.24 0.87 1.34 0.432.91 2.58 1.702.14XIC of+MRM(6 pairs):337.300/322.300 Da ID:LMG-D from Sample 23(BLANK)of DataSET1.wiff(Turb.Max.3.9e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.03.9e5I.6.775.40 7.067.17 DB12/T 8662019 10 E E 附 录 E（资料 性附 录）空白水 质加 标特 征离 子色 谱图（20 ng L-1）XIC of+MRM(6 pairs):329.300/313.100 Da ID:MG-313 from Sample 13(QC-5)of DataSET1.wiff(Turbo.Max.8.9e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.05.0e58.9e5I.4.256.824.38XIC of+MRM(6 pairs):334.300/318.200 Da ID:MG-D from Sample 13(QC-5)of DataSET1.wiff(Turbo S.Max.1.7e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.01.0e51.7e5I.4.246.764.42XIC of+MRM(6 pairs):331.300/316.300 Da ID:LMG-316 from Sample 13(QC-5)of DataSET1.wiff(Turb.Max.7.7e4 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.05.0e47.7e4I.6.811.68 4.25XIC of+MRM(6 pairs):337.300/322.300 Da ID:LMG-D from Sample 13(QC-5)of DataSET1.wiff(Turbo.Max.4.1e5 cps.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time,min0.04.1e5I.6.765.41 6.977.11 _