ICS 07.060 CCS A 45 山东省地方标准 DB37/T 4298 2020 37 绿潮次生 毒性的快 速检测方 法 发光 细菌法 Rapid determination for secondary toxicity of green tide Luminescent bacteria method 2020-12-30 发布 2021-01-30 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 4298 2020 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由 山 东省 海洋 局提出 并组 织实 施。本文件 由 山 东省 海洋 标准 化技术 委员 会 归 口。本文件 起草 单位：山 东省 海洋资 源与 环境 研究 院、山东省 标准 化研 究院。本文件 主要起 草人：宋秀 凯、付 萍、张 秀珍、刘晓 波、刘 爱英、姜会 超、何 健龙、程玲、于广 磊、杨沣江。DB37/T 4298 2020 1 绿 潮次生 毒性的快 速检测 方法 发 光细菌 法 1 范围 本 文件 规定 了以 一种 发光 细菌-费氏 弧菌（Vibrio fischeri）为受 试生 物的绿 潮次生 毒性 快速 检 测与毒性 水平 评价 方法。本 文件 适用 于绿 潮发 生海 域绿潮 藻腐 烂液 次生 毒性 的检测。2 规范性 引用 文件 本文件 没有 规范 性引 用文 件。3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 绿潮次 生毒 性 secondary toxicity of green tide 绿潮藻 腐烂 分解 产生 的物 质对生 态环 境产 生的 影响 及损害 的能 力。3.2 光抑制 率 light inhibition rate 水样在 一定 的时 间和 条件 下与发 光细 菌接 触后，发 光细菌 的发 光量 降低 的百 分比。3.3 光增益 率 light gain rate 水样在 一定 的时 间和 条件 下与发 光细 菌接 触后，发 光细菌 的发 光量 增加 的百 分比。3.4 半数效 应浓 度 median effect concentration 样品在 一定 的时 间和 条件 下与发 光细 菌接 触后，发 光细菌 的发 光量 减少50%时的样 品浓 度。3.5 水合 reconstitution 处于冷 藏环 境的 发光 细菌 冻干粉 加入 一定 量的 稀释 剂恢复 至活 性。3.6 水合时 间 reconstitution time 添加稀 释剂 的发 光细 菌恢 复至活 性所 需要 的时 间。3.7 反应时 间 reaction time 恢复至 活性 的发 光细 菌与 对照样 本或 者待 测样 本接 触的时 间。4 方法原 理 DB37/T 4298 2020 2 发光细 菌在 一定 实验 条件 下的发 光强 度是 稳定 的。在一定 绿潮 次生 污染 物范 围内，发光 细菌接触样品后的 发光强 度与 样品的 急性毒 性水平 呈显 著负相 关（P0.05），通 过分 析 仪测定 细菌发 光强 度的 变化以表 示样 品的 急性 毒性 水平。5 试剂与 材料 5.1 发光细 菌冻 干粉 本 文件 使用 的发 光细 菌菌 株为费 氏弧 菌（Vibrio fischeri NRRL B-11177）。冻干粉 应在-20-25 储存，4 时，保 存 时间不 超过4周；22 时，不超 过24 h。5.2 稀释剂 稀释剂 为2%氯 化钠 溶液，用作水 合发 光细 菌冻 干粉、稀释样 品以 及无 毒对 照样 本。2 8 保存。宜选用 与冻 干粉 相应 的稀 释剂。5.3 参比毒 物母 液 称取0.05 g 七水 合硫 酸锌（ZnSO4 7H2O、分析 纯）溶解 于稀释 剂中，定容 至500 mL，即 为参 比毒 物 母液（100 mg/L）。母 液密 封4 保存，保 存期 不超 过6个 月。5.4 参比毒 物标 准液 按照等 差、等比 倍数 相结 合的方 式，采用 梯度 稀释 法将参 比毒 物母 液依 次稀 释至6 mg/L、4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L 和0.25 mg/L，用 于测 定发 光 强度并 制作 标准 曲线。标 准液应 现用 现配。6 仪器设 备 仪器和 设备 如下：生物毒 性分 析仪；温度计：5+40；离心机：5 000 r/min；电子天 平：感量 0.00 1 g。7 样品的 采 集、保 存和 预处 理 7.1 样品的 采集 参照GB 17378.3 的规 定，溶解氧、生化 需氧 量样 品 采集时 应防 止搅 动水 体，水样不 应 曝 气。避 免采集漂浮物，水样充满样 品瓶，并记 录当时现场的水温。样品 瓶采用经过灭菌的50 mL 棕色玻璃瓶。样 品信息采 集表 参见 附录A。7.2 样品的 保存 样品采 集后宜 在现 场尽快 进行毒 性测定。若 在实验 室内测 定，样 品4 保存，24 h 内测定；不 能 在24 h 内 测定 的，转入50 mL 冻存管 内，于-20 避光 保存，1周 内测 定。7.3 样品的 预处 理 DB37/T 4298 2020 3 浑浊的 样品 应通 过沉 淀或 使用离 心机 以5 000 r/min，离心1 min 后，取 上清 液 进行毒 性测 试。8 样品的 检测 8.1 实验室 温度 的校 正 实验室 检测 时，调节 室内 温度与 采样 地温 度接 近。温差控 制在 2。8.2 样品管 的准 备 根据样 品数 量，准备 相应 数量的 测试 管：对照 样品 管23个（3 个重 复），待 测样品 管2 n 3 个(n:样品数量)。将测试管在小试管架中平均排成两排，第一排编码为A1、A2、A3 An；第二排编码为B1、B2、B3 Bn，前 后两 排一 一对应。注：n 应小于10。8.3 发光细 菌冻 干粉 的水 合 根据待 测样 品的 数量，从 冷冻 环 境中 取出 相应 数量 的发光 细菌 冻干 粉，轻 敲 小瓶，确 保冻 干细 菌充分落在 瓶子 底部。加 入稀 释剂，水合 时间15 min。若 水合单 瓶冻 干粉，向 每只 冻干粉 中添 加300 L稀释剂，用 调至100 L 的移 液 器混合3 4次；若 水合多 瓶冻干 粉，需 向每 支冻干 粉中加 入300 L稀 释液，然后将所有 水合试剂并入一个新试管 中，用调至500 L的移液器混合34次。在等待水 合过程中，可将稀释 剂、待测 水样 各取1 000 L分 别加 入A1 管及A2 An 管 中。8.4 发光细 菌初 始相 对发 光值 的测定 冻 干 粉水 合15 min之 后，水 合 液由 浑 浊变 为清 澈。依 次 向B1、B2、B3 Bn 小试 管 中添 加100 L水合液，并依 次将B1 Bn 放 入检测 仪中 进行 初始 相对 发光值 检测。8.5 反应后 发光 细菌 相对 发光 强度值 测定 当第Bn 个小 试管 读数 结束 放回试 管架 后，5 min 反应 时间倒 计时 开始，迅 速取A 列溶液900 L 加到 对应的B 列小 试管 中，混匀。待反应 结束 后，依次 对B1、B2、B3 Bn 发 光值 读数。9 标准液 检测 测定同 一批 样品 或开 始使 用一批 新的 发光 菌冻 干粉 试剂时 均需 进行 毒性 测定。测试 步骤 同8。10 数据处 理 10.1 光抑制 率/光增 益率 的计 算 光抑制 率/光增 益率I 计算 方法见 公式(1)：(1)式中：So 测试 样品 管初 始 相 对发光 强度 值；St 测试 样品 管反 应5 min 后相 对发 光强 度值；f 反应5 min 校正 因子，计算 方法 见公 式(2)：DB37/T 4298 2020 4(2)式中：Co 对照 样品 管初 始相 对发光 强度 值；Ct 对照 样品 管反 应5 min 后相 对发 光强 度值。10.2 EC50 的计 算 以I值 为横 坐标，ZnSO4 7H2O 浓度 为纵 坐标 做对 数趋 势 线预测，得 出相 关系 数R 并 计算出EC50。11 质量控 制 样品检 测时 应注 意：反应5 min 校正 因子f 应为 0.6 1.8，否则 更换 冻 干粉；15 35，反应5 min 标准 液ZnSO4 7H2O 的EC50 范围 为1 mg/L 10 mg/L。12 毒性水 平评 价 样品毒 性水 平的 表征 方法 采用反 应5 min 发光 抑制/增益率I进 行评 价。具体 评 价方法 为：根据I 值将 毒性 等级 分为4 级，1、2、3、4 级分 别为 无毒性 风险、低 度毒 性风 险、中 度毒 性风 险、高度毒性 风险，分 级方 法见表1。测试 结果 报表 参见 附 录B。表1 毒性风 险等 级评 价方 法 毒性等级 I 毒性风险等级 1 I 0 无毒性风险 2 0 I 30%低度毒性风险 3 30%I 80%中度毒性风险 4 I 8 0%高度毒性风险 DB37/T 4298 2020 5 A A 附录A（资料 性）样品信 息采 集表 样品信 息采 集表 见表 A.1。表A.1 样品信 息采 集表 监测单位：（章）填表日期：年 月 日 共 页 第 页 采样者 发光菌、仪器名称 样品编号 采样时间 经度 纬度 水温 保存方式 运输方式 分析 者 校对者 审核者 DB37/T 4298 2020 6 B B 附录B（资料 性）测试结 果报 表 测试结 果报 表见 表B.1。表B.1 测试结 果报 表 监测单位：（章）填表日期：年 月 日 共 页 第 页 检测时间 检测时温度 校正因子 f 参比毒物标准液检测 ZnSO4 7 H2O mg/L I%I 均值%线性回归方程 相关系数 R EC50 样品检测 样品编号 温差 是否离心 I%I 均值%毒性等级 分析者 校对者 审核者 DB37/T 4298 2020 7 参考文 献 1 GB 17378.3 海洋 监 测规范 第3部 分：样品 采 集、贮 存与 运输