ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 27882017 猫泛白细胞减少症诊断 实时荧光PCR法 The diagnostic of Feline panleukopenia virus Real-time PCR method 2017-12-11发布 2018-04-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 27882017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林农业大学、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：程荣华、呼延含蓉、王开、郭衍冰、王楠、丁世杰、邵洪泽、于钦磊、白翠、李昱洁、陆伟、何浩、刘沂霖、赵欣、肖玉海、王辉。DB22/T 27882017 1 猫泛白细胞减少症诊断 实时荧光PCR 法 1 范围 本标准规定了猫泛白细胞减少症实时荧光PCR方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于猫泛白细胞减少症的实验室诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）Ct：循环阈值（Cycle threshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）4 材料 4.1 仪器设备 4.1.1 分析天平，感量 0.1 mg。4.1.2 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。4.1.3 荧光定量 PCR 扩增仪。4.1.4 冰箱，2 8 和-20 两种。4.1.5 可调移液器，最大量程为 10 L，200 L，1 000 L。4.1.6 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100。4.1.7 高压蒸汽灭菌器。4.1.8 干热箱。4.2 器械与耗材 4.2.1 组织匀浆器或研钵。4.2.2 医用剪刀。4.2.3 医用镊子。4.2.4 1.5 mL 离心管。4.2.5 15 mL 离心管。4.2.6 50 mL 离心管。DB22/T 27882017 2 4.2.7 1 000 mL 量筒。4.2.8 1 000 mL 容量瓶。4.2.9 PCR 八联排管。4.2.10 吸头，10 L，200 L，1 000 L。4.2.11 医用棉签。4.3 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。4.3.1 0.02 mmol/L PBS，见附录A。4.3.2 基因组 DNA提取试剂盒。4.3.3 SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2）。4.3.4 灭菌双蒸水。4.4 引物 上游引物 F：5-AATGCTTGGGGAGTTTGGTTT-3。下游引物 R：5-TTTAGTTGGTGGCTGAGTAGCAGA-3。5 操作步骤 5.1 采样器具前处理 5.1.1 组织匀浆器或研钵（4.2.1）、医用剪刀（4.2.2）、镊子（4.2.3）经160 干热灭菌2 h。5.1.2 离心管经 121 2 高压蒸汽灭菌 15 min。5.2 样品的采集和处理 5.2.1 用拭子（4.2.11）采集猫眼周分泌物、鼻液、粪便，采集样品的拭子用少量 PBS（4.3.1）浸润后，3 000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。5.2.2 采集病死猫肠道、肝、脾等组织器官，加等体积 PBS（4.3.1）研磨匀浆，3 000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。5.3 DNA 提取 按照基因组 DNA 提取试剂盒说明书要求操作，提取的基因组 DNA 应迅速进行荧光定量 PCR 扩增，或置于-20 冰箱（4.1.4）备用。5.4 反应体系 5.4.1 实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 1。表1 实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 上游引物 F(10 mol/L)1.0 L 下游引物R(10 mol/L)1.0 L 待检样品DNA 2.0 L 灭菌双蒸水 8.5 L DB22/T 27882017 3 表1（续）试剂 剂量 SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（2）12.5 L 总体积 25.0 L 5.4.2 以灭菌双蒸水为阴性对照，以猫泛白细胞减少症病毒基因组 DNA 或含目的片段的阳性质粒为阳性对照。5.5 反应程序 实时荧光 PCR 反应程序见表 2。表2 实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 温度 时间 s 循环数 次 第一步 95 30 1 95 5 第二步 60 30 40 6 结果判定 6.1 结果分析条件设定 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。6.2 质控标准 6.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无典型扩增曲线。6.2.2 阳性对照的 Ct 值应35.0，并出现特定的扩增曲线。6.2.3 如阴性对照和阳性对照不满足以上所有条件，实验结果视为无效。6.3 结果描述及判定 6.3.1 无 Ct 值，无典型的扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为阴性。6.3.2 Ct 值35.0，出现典型的扩增曲线，判为阳性。6.3.3 35.0Ct 值40.0，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，结果仍为疑似，判定为阳性。DB22/T 27882017 4 A A 附 录 A（规范性附录）磷酸缓冲生理盐水 A.1 A液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液，称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1 000 mL，混匀。A.2 B液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液，称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1 000 mL，混匀。A.3 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制 量取 0.2 mol/L 的 A 液 360 mL，0.2 mo1/L 的 B 液 140 mL，称取氯化钠 38 g，用去离子水溶解稀释至 5 000 mL，4 保存。_