ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 1864.2 2022 家禽疫病 诊断技术 规程 第2 部分：禽大肠杆 菌致病群 双重探针 法检测 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series Part 2:Testmethodof dual probe PCR for detecting pathogenic Escherichia coli 2022-05-26 发布 2022-07-26 实施 湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T 1864.2 2022 I 目 次.II.IV 1.1 2.1 3.1 4.1 5.1 6.2 7.2 8.2 9.3 10.4 11.4 DB42/T 1864.2 2022 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB42/T 1864 DB42/T 1864 2 DB42/T 1864 1 2 3 PCR 4 ELISA 027-87665821 027-87284950 DB42/T 1864.2 2022 III DB42/T 1864.2 2022 IV 引 言 2012 2020 4 J PCR ELISA ELISA DB42/T 1864.2 2022 1 家 禽疫病 诊断技术 规程 第 2 部分：禽大肠 杆菌致 病群双重 探针法 检测 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 27403 NY/T 555 3 术语和 定义 3.1 大肠杆 菌 致 病群 escherichia coli phylogenetic group B2 D B1 A B2 D 3.2 荧光PCR realtime PCR DNA PCR 4 缩略语 BHQ1-l Black Hole Quencher-1 Ct Cycle threshold FAM Fluorescein Amidite HEX Hexachloro-Fluorescein 5 原理 DB42/T 1864.2 2022 2 Taqman chuA yiaA DNA TspE4.C2 B2 D B1 A 1 B2 D chuA yiaA Taqman Ct 表1 大肠杆 菌种 群的 判定 chuA yiaA TspE4.C2 B2/D/B1/A/6 试验条 件 7 仪器设备 7.1 PCR 7.2 7.3 7.4 1 mL 100 L 50 L 2.5 L 7.5 36 1 7.6 12 000 r/min 8 试剂 或 材料 8.1 试剂配 制 GB/T 6682 GB/T 27403 8.2 试剂或 材料 8.2.1 Cary-Blair 8.2.2 PCR 8.2.3 DNA 8.2.4 chuA-CTGGGTGGAGTGATCTCCTA-TGCCGCCAGTACCAAAG-FAM-TTGCAGGAAGGACAAAGCAGTGGT-BHQ1-8.2.5 yjaA 5-GAAAGCAAACGTGAAGTGTCAG-3 DB42/T 1864.2 2022 3 5-GGTGGAGTTGCAGAACAAGA-3 5-HEX-CCAGCGCCTGTTAATCGCCAATTT-BHQ1-3 8.2.6 1 chuA DNA DNA 8.2.7 2 yjaA DNA DNA 8.2.8 8.2.9 DNase/RNase qPCR EP 1.5 mL 9 试验步骤 9.1 样品的 采集 与前 处理 9.1.1 泄殖腔 拭子 样品 2 cm 3 cm 1 mL 2 mL 24 h 9.1.2 粪便样 品 1 g 2 g 1 mL 2 mL 24 h 9.2 大肠杆 菌的 分离 鉴定 NY/T 555 9.3 样品DNA 的 制备 9.3.1 36 18 h 24 h 12 000 r/min 2 min 9.3.2 100 L DNA 10 min 4 12000g 5min PCR 9.3.3 DNA DNA 9.4 荧光PCR 检测 9.4.1 反应体 系 DNA PCR 25 10 mmol/L 0.6 10 mmol/L 0.8 PCR 12.5 DNA1 25 9.4.2 反应条 件 PCR PCR FAM HEX chuA-FAM yjaA-HEX 5 min 10 sec 30 sec 40 9.4.3 对照 DB42/T 1864.2 2022 4 1 2 10 结果判 定 10.1 质控标 准 Ct Ct 35 FAM HEX Ct 10.2 结果分 析 2 3 表2 chuA、yjaA 基 因检 测结 果 的分析 Ct FAM chuA PCR Ct 40 chuA PCR 35 40 Ct 35 40 Ct 37 chuA PCR chuA PCR HEX yjaA PCR Ct 40 yjaA PCR 35 40 Ct 35 40 Ct 37 yjaA PCR yjaA PCR 表3 大肠杆 菌致 病群 的判 定 B2 chuA PCR yjaA PCR D chuA PCR yjaA PCR chuA PCR yjaA PCR 10.3 检测注 意事 项 DNA 11 生物安 全措 施 GB 19489