ICS 65.020.01 CCS B 25 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2602 2022 苜蓿中咪 草烟残留 量的测定 高效液相 色谱法 Determination ofImazethapyr residue in alfalfa-Highperformance liquid chromatography 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2602 2022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 原理.1 5 试 剂和 材料.1 6 仪 器和 设备.2 7 试 样制 备.2 8 测 定步 骤.2 9 结 果计 算和 表示.3 10 精 密度.4 附录A（资 料性）高效 液相色 谱法 测定 咪草 烟标 准溶液 色谱 法.5 DB15/T 2602 2022 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由 内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：中国 农 业科学 院草 原研 究所、内 蒙古自 治区 农畜 产品 质量 安全中 心、内 蒙古 自治区产品 质量 检验 研究 院、太仆寺 旗现 代农 牧业 综合 服务中 心。本文件 主要 起草 人：吴洪 新、王 文曦、云 颖、盈盈、付慧、黄 奕颖、杨 红东、姚继 红、王冠、云 岩春、张慧 泽、刘 洪林、卫 媛、李薇、李润 航、降晓 伟、李坤 娜、张 燕东、刘 宇宁、湖 日尔、刘江 英、赵志惠。DB15/T 2602 2022 1 苜蓿中咪 草烟残 留量的测 定 高效液相 色谱法 1 范围 本文件 规定 了高 效液 相色 谱法测 定苜 蓿中 咪草 烟残 留量的 原理、试剂 和材 料、仪器和 设备、试样 制备、测 定步 骤、结果 计算 和表示、精 密度。本文件 适用 于苜 蓿中 咪草 烟残留 量的 测定。本文件 的检 出限 为0.025 mg/kg。本文件 的 定 量限 为0.10 mg/kg。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动 物饲 料试 样 的制备 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 原理 试样 中 咪草 烟残 留物 样品 经过甲 醇和 碳酸 钠提 取液 提取、离心、萃取、旋 蒸，用离子 交换 型（SCX）固相萃 取小 柱净 化，甲醇 和氨水 洗脱，用 高效 液相 色谱仪 测定，外 标法 定量。5 试剂和 材料 乙腈（CH3CN）：色 谱纯。甲醇（CH3OH）：色 谱纯。磷酸（H3PO4）：优 级纯。二氯甲 烷（CH2Cl2）。冰乙酸（CH3COOH）：优 级 纯。氨水（NH4OH）。无水硫 酸钠（Na2SO4）：优级纯。碳酸钠（Na2CO3）：优级 纯。碳酸钠 溶液（0.1mol/L）：称 取10.6 g 碳酸 钠，用 水溶解，定 容 至1 L 容量 瓶中。DB15/T 2602 2022 2 甲醇-碳酸 钠溶 液（1+1，v/v）：量 取100 mL 甲醇，加入 100 mL 碳 酸钠 溶液（5.9），混 匀。磷酸溶 液（1+9，v/v）：量取 10 mL 磷酸，用 水稀 释定容 至 100 mL。氨水-甲醇（1+9，v/v）：量取10 mL 氨水，加 入 90 mL 甲 醇，混匀。水+甲 醇（1+9，v/v）：量 取 10 mL 水，加 入90 mL 甲醇，混匀。乙酸溶 液（5+95，v/v）：量取5 mL 冰乙 酸，用水 稀 释定容 至 100 mL。标准品：咪 草烟（C15H19N3O3）：纯 度不 小 于95%，或经国 家认 证并 授予 标准 物质证 书的 标准 物质。标准储 备液(1.00 mg/mL)：准 确称 取适 量的 咪草烟 标准物 质，用 甲醇 溶解并 配制成(1.00 mg/mL)的标准 储备 液，保存 于-18 冰 箱内，可 使用6 个月。标准使 用液：准确 吸取 0.10 mL 咪草 烟的 标准 储备液(5.16)至 10 mL 容量 瓶内，用甲醇 稀释 定容至刻度，配 制 成 10.0 g/mL 的 标准 溶液，于-18 冰箱 内避 光保 存，可使 用 1 个 月。标准系 列工 作液：分 别吸 取浓度 为 10.0 g/mL 咪 草烟标 准液 0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL 于10.00 mL 容 量瓶，用 水+甲醇(5.13)定容 至刻 度，该标 准 系列咪 草烟 浓度 分别 为0.25 g/mL、0.50 g/mL、1.00 g/mL、1.50 g/mL、2.00 g/mL。固相萃 取柱：SCX，60 mg/3mL。微孔过 滤膜（尼 龙）：13 mm 0.22 m。注：除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T 6682 所规定的一级水。6 仪器和 设备 高效液 相色 谱仪：配 有紫 外检测 器（或二 极管 阵列 检测器）。电子天 平：感 量0.01 mg 和0.01 g。离心机：转 速大 于等 于 4000 r/min。超声波 水浴。旋转蒸 发仪。涡旋混 合器。氮吹仪。组织粉 碎机。样品筛：筛 孔尺 寸1.0 mm。7 试样制 备 按照GB/T 14699.1 中 有关 规定采 集样 品，去杂 质后 充分混 匀，按照GB/T 20195 制备 试样，利 用四 分法取样 后，充分 研磨，过1.0 mm 筛，新 鲜样 品利 用四 分法取 样后，充 分破 碎作 为分析 样品 备用，将 处 理好的试 样放 置-18 冰箱 保 存。8 测定步 骤 提取 准确称 取苜 蓿新 鲜样 品5 g（精确 至0.01g）或 草粉2 g（精 确至0.01g）于50 mL 的塑料 离心 管中，加入30 mL 的甲 醇-碳 酸钠 溶液（5.10），混匀，超 声提取30 min，用 磷酸 溶 液（5.11）调 至pH=2.5，于4000 r/min 离心10 min，收 集上清 液于 分液 漏斗 中，用50 mL 二 氯甲 烷（5.4）萃 取两次（25 mL+25 mL），DB15/T 2602 2022 3 有机相 加适 量无 水硫 酸钠（5.7）除水 后收 集于 旋转 蒸 发瓶中，于45 减 压蒸 至 近干，加 适量 甲醇（5.2）溶解。净化 强阳离 子交 换固 相萃 取柱SCX（5.19）净 化，用1 mL 水、1 mL 甲醇（5.2）活化 固相萃 取柱，试 样全部过柱，用1 mL 水、1 mL 甲醇（5.2）淋洗 固相 萃取 柱，再 用6 mL氨水-甲醇（5.12）洗脱，收 集流 出 液于10 mL 比 色管 中，整 个固 相萃取 过程 流速 不超 过1 mL/min。洗 脱液 于50 条 件下氮 吹至 近干，用2.00 mL水-甲醇（5.13）溶解、涡旋混 匀，过0.22 m微 孔过滤 膜（5.20），待测。测定 8.3.1 相液色 谱测定 参 考条 件 液相色 谱法 测定 参考 条件 如下：a)色谱柱：C18 型 柱，长 150 mm，内径3.9 mm，粒径5 m，或等 效的 色谱 柱；b)流动相：A:乙酸（5.14）+B:乙腈（5.1）=60+40（v/v）；c)流速：1.0 mL/min；d)进样量：10.00 L；e)柱温：40；f)检测波 长：258 nm。8.3.2 标准曲 线 的 制作 按照8.3.1 测定 条件，将 标 准工作 液（5.18）注 入高 效 液相色 谱仪 中进 行测 试。测定相 应的 峰面 积，以标准 工作 液（5.18）的 浓度为 横坐 标，以峰 面积 为纵坐 标，绘制 标准 曲 线。8.3.3 试样溶 液的 测定 按照8.3.1 测 定条 件，将 待 测样品 溶液注 入高 效液相 色谱仪 中进行 测试。待测 样品溶 液中目 标物 质的响应 值应 在仪 器线 性范 围内，否 则应 适当 稀释。标 准工作 液与 待测 样品 溶液 等体积 进样。根据 标准 溶液色谱 峰的 保留 时间 和峰 面积，对 试样 溶液 的色 谱 峰根据 保留 时间 进行 定性，外 标法 定量。咪草 烟标准溶液色 谱图 见附 录A 中图A.1。平行实 验 按上述 步骤，对 同一 试样 进行平 行试 验测 定。空白实 验 除不称 取试 样外，均 按上 述分析 步骤 进行。9 结果计 算和 表示 试样中 咪草 烟含 量X 按式（1）计 算：X=（C-C 0）Vm(1)式中：X 试样 中咪 草烟 的含 量，mg/kg；DB15/T 2602 2022 4 C 待测 液中 咪草 烟的 浓度，g/mL；C0 试剂 空白；V 试样 溶液 定容 体积，mL；m 试样 的称 样量，g。注：测定结果用算术平均值表示，保留两位有效数字。10 精密度 在实验 室内 重复 性条 件下 获得 的 2 次 独立 测定 结果 的绝对 差值 不超 过算 数平 均值 10%。在实验 室间 再现 性条 件下 获得 的 2 次 独立 测定 结果 的绝对 差值 不超 过算 数平 均值 的 15%。DB15/T 2602 2022 5 A A 附录A（资料 性）高效液 相色 谱法 测定 咪草 烟标准 溶液 色谱 法 高效液 相色 谱法 测定 咪草 烟标准 溶液 典型 色谱 图见 图A.1。图A.1 高效液 相色 谱法 测定 咪草 烟标准 溶液 典型 色谱 图