ICS 67S X 0安禽蛋Determ2021-0050 04 徽蛋中替mination o09-03 发布徽替米考of tilmicos布 安省考星残in residue安徽省市场地 残留的谱法es in egg-h 场监督管理方的测定法 high perfo 理局 发方DB定 高ormance li发 布34标B34/T 399高效液iquid chro2021-4 准912021 液相色omatograp-10-03 实准 色phy实施DB34/T 39912021 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省兽药饲料监察所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽安丰堂动物药业有限公司、安徽省兽药饲料监察所、利辛县双飞养殖专业合作社、安徽省动物卫生监督所、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省农科院畜牧兽医研究所、桐城市畜牧兽医管理中心、宣州区畜牧兽医管理局。本文件主要起草人：张莉、刘红云、张士卿、苗文萍、章天霞、蔡一杰、郑举、吴蕾、李珲、王雨霜、刘文文、王群、马瑞钰、丁常宏、杜腾飞。DB34/T 39912021 1 禽蛋中替米考星残留的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了禽蛋中替米考星残留检测的试样制备及高效液相检测方法。本文件适用于禽蛋中替米考星的残留测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样中的替米考星加乙腈经涡旋匀浆后离心取上清液，正己烷液液分配去脂，固相萃取柱净化，旋转蒸发浓缩，经色谱柱梯度洗脱分离，用紫外检测器检测，以保留时间进行定性，外标法定量。5 试剂和材料 5.1 用水符合 GB/T 6682 中一级用水的规定。5.2 甲醇：色谱纯。5.3 乙腈：色谱纯。5.4 正己烷：分析纯。5.5 无水硫酸钠：分析纯。5.6 磷酸：分析纯。5.7 二丁胺：分析纯。5.8 氢氧化钠：分析纯。5.9 替米考星对照品：95.0。5.10 固相萃取柱：HLB（6 mL，200 mg）或同等柱效。5.11 替米考星标准溶液的制备：取替米考星对照品 25.0 mg，精密称定，置 25 mL 容量瓶中，加乙腈制成每1 mL 中含 1 mg 的溶液，精密量取 5 mL，置25 mL 量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成0.2 mg/mL 的标准储备液。在试验中用磷酸溶液配置成不同浓度的标准工作液，现配现用。DB34/T 39912021 2 5.12 磷酸溶液的配制：取水 900 mL，加磷酸 5.71 g，用12.5 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至2.50.1，加水至 1000 mL。5.13 12.5 mol/L氢氧化钠溶液的配制：称取 50 g 氢氧化钠，溶于水，加水稀释至 100 mL。5.14 乙腈饱和的正己烷的配制：取 100 mL 的正己烷加入 10 mL 的乙腈，充分振荡混合后，上层溶液为乙腈饱和的正己烷。5.15 磷酸二丁胺缓冲液：取二丁胺 16.8 mL，加磷酸溶液（110）70 mL，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节 pH 至2.50.1，加水至 100 mL。6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪(配有紫外检测器或二级管阵列检测器、柱温箱)。6.2 分析天平：感量 0.1 mg、0.01 mg。6.3 离心机：低温冷冻离心机（6770G）。6.4 超声波清洗机。6.5 涡旋混合机。6.6 微孔滤膜：孔径 0.45 m纤维素滤膜。6.7 旋转蒸发器。7 试样的制备 取待测新鲜的禽蛋去壳，充分搅拌，匀质。于-18以下保存。8 分析步骤 8.1 提取 称取 5 g0.05 g 试样，置于 50 mL 离心管中，用 10 mL 乙腈匀浆 5 min，高速冷冻 6770G 离心 10 min，移取上清液于 50 mL 离心管中。离心管中的残渣再用 10 mL 乙腈重复提取，合并上清液。在合并的上清液中加入无水硫酸钠 3.0 g，乙腈饱和的正己烷 20 mL，涡旋 1 min，6770G 离心 10 min，弃去上层正己烷。取下层溶液备用。8.2 净化 将 HLB 固相萃取柱分别用 5 mL 甲醇和乙腈依次润洗，加入提取液 5 mL，过柱，弃去淋洗液，用5 mL 乙腈进行洗脱，收集洗脱液于茄形瓶中，于 40旋转蒸发至近干，浓缩液加入 1.00 mL 磷酸溶液溶解，过 0.45 m 滤膜后，转移至 2 mL 进样瓶中，待测定。8.3 测定 8.3.1 高效液相色谱条件 色谱柱：ODSC18(4.6 mm250 mm，5 m)。流动相：水磷酸二丁胺缓冲液（975：25）为流动相A，乙腈为流动相B，按表1 程序进行梯度洗脱。流速柱温检测进样 8.3.2 面积均应8.4 空 在8.5 结试料 式中X C m V f 注：9 检测9.1 灵本方9.2 准本方9.3 精速：1.0 mL/温：30。测波长：280 样量：10 L时间（min）0 30 32 40 取试样溶液应在仪器检测白实验 不含替米考星果的计算与表料中替米考星中：供试试样经标准曲试样质量定容体积稀释倍数 结果表示方法的灵敏度敏度 方法检出限为确度 方法在 20 g密度/min。nm。、标准溶液上测的线性范围星的试样，采表述 星残留量（g样中替米考星曲线求得的试量，单位为克积，单位为毫数 平行测定结果度、准确度和为 2 g/kg，g/kg100 表上机测定，按围内（见附录采用完全相同g/kg）按公式星含量，单位试样溶液中替克（g）；毫升（mL）果用算术平均值和精密度 定量限为 2g/kg 添加浓表1 梯度洗脱流动相A（）82 60 82 82 按外标法以峰录 A）。同的测定步骤式(1)计算：位为微克/每千替米考星浓度 值表示，计算结0 g/kg。浓度水平上的脱程序 峰面积定量，骤进行测定（千克（g/kg，单位为微克结果保留 3 位有 的回收率为 7标准溶液及（见附录A）。）；克/每毫升（有效数字。0110DB34/T 流动相B（）18 40 18 18 及试样溶液中。（g/mL）；。399120213 中替米考星峰(1)峰 DB34/T 39912021 4 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV15。空白 白样品添加替 图 空白样替米考星对照图A.1 空白样品添加替米考照品溶液和空样品中添加图A附录A（资料性）考星对照品溶空白样品色谱1.0ng/mL 替A.2 空白样品A）溶液和空白样谱图见图A.1、替米考星色谱品色谱图 样品色谱图 图A.2。谱图（峰 1、峰DB34/T 峰 2）399120215