I C S 6 5.0 2 0.3 0 C C S B 4 153云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 1纯 种 绿 孔 雀 鉴 定 技 术 规 程T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r i d e n t i f i c a t i o n o f p u r e P a v o m u t i c u s2 0 2 1-0 9-3 0 发 布 2 0 2 1-1 0-1 4 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 1I目 次前 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 形 态 鉴 定.14.1 鉴 定 材 料.14.2 鉴 定 内 容.24.3 形 态 特 征.24.4 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 性 状 差 别.24.5 疑 似 绿 孔 雀 个 体 形 态 鉴 定.25 分 子 鉴 定.25.1 鉴 定 材 料.35.2 鉴 定 原 理.35.3 样 品 采 集.35.4 D N A 制 备.35.5 基 因 组 重 测 序.45.6 参 考 基 因 组 选 择.45.7 纯 种 鉴 定.4附 录 A（资 料 性）蓝 孔 雀 和 绿 孔 雀 性 状 对 比 图.5附 录 B（资 料 性）D N A 样 品 的 提 取 与 检 测.6附 录 C（资 料 性）试 剂 及 仪 器 设 备.8附 录 D（资 料 性）鉴 定 结 果 样 表.9D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 1I I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局、云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 2）归 口。本 文 件 主 要 起 草 单 位：中 国 科 学 院 昆 明 动 物 研 究 所、云 南 省 标 准 化 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：董 锋、黄 艳 梅、单 鹏 飞、李 建 春、王 洁、李 杰、吴 飞、伍 和 启、高 建 云、岩 道、常 江、杨 晓 君。D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 11纯 种 绿 孔 雀 鉴 定 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 纯 种 绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）鉴 定 技 术 的 形 态 鉴 定、分 子 鉴 定。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 的 纯 种 鉴 定。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 3 0 9 8 9-2 0 1 4 高 通 量 基 因 测 序 技 术 规 程G B/T 3 5 8 9 2 实 验 动 物 福 利 伦 理 审 查 指 南3 术 语 和 定 义G B/T 3 0 9 8 9 界 定 的 以 及 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1物 种 鉴 定 s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n通 过 形 态 特 征、分 子 鉴 定，确 定 检 测 样 本 是 否 为 纯 种 个 体 的 过 程。3.2基 因 组 g e n o m e一 种 生 物 体 具 有 的 所 有 遗 传 信 息 的 总 和。来 源：G B/T 3 0 9 8 9-2 0 1 4，3.2 3.3参 考 基 因 组 序 列 r e f e r e n c e g e n o m e s e q u e n c e通 过 对 某 个 物 种 的 基 因 组 进 行 从 头 测 序，利 用 生 物 信 息 学 分 析 方 法 进 行 拼 接、组 装，而 获 得 的 基 因组 序 列 信 息。3.4基 因 组 重 测 序 g e n o m e r e s e q u e n c i n g针 对 有 参 考 基 因 组 序 列 的 物 种 的 不 同 个 体 进 行 基 因 组 测 序，以 获 取 个 体 或 群 体 间 的 差 异 性 信 息。3.5小 片 段 基 因 组 文 库 s m a l l-i n s e r t g e n o m i c l i b r a r y片 段 大 小 在 1 k b 以 下 的 普 通 D N A 文 库（2 0 0 b p、3 5 0 b p、5 0 0 b p 等），可 用 于 基 因 组 重 测 序。4 形 态 鉴 定4.1 鉴 定 材 料D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 12供 鉴 定 的 个 体 应 为 绿 孔 雀 亚 成 体 或 成 体。4.2 鉴 定 内 容鉴 定 内 容 见 表 1。表 1 绿 孔 雀 形 态 学 鉴 定 内 容性状 鉴定项目整体性状 体型、体色冠羽性状 冠羽颜色、形状、羽轴结构面部性状 眼先颜色、裸皮颜色、形状颈胸、背部性状 羽色、形状4.3 形 态 特 征4.3.1 整 体 性 状4.3.1.1 个 体 较 大，雄 性 体 重 3 8 5 0 g 5 0 0 0 g，雌 性 体 重 1 0 6 0 g 1 1 6 0 g，体 羽 主 要 呈 金 翠 绿 色。4.3.1.2 雄 鸟 头 顶 具 一 簇 直 立 的 冠 羽，下 背 具 闪 耀 紫 辉 的 铜 钱 状 花 斑；尾 屏 发 达，长 可 达 1 m，羽 端有 一 闪 耀 蓝 色 和 翠 绿 色 相 嵌 的 眼 状 斑；尾 羽 黑 褐 色，形 短 而 隐 于 尾 屏 下；初 级 覆 羽 和 初 级 飞 羽 棕 黄 色。4.3.1.3 雌 鸟 无 尾 屏，初 级 飞 羽 外 翈 有 黑 色 横 斑，背 羽 多 呈 黑 褐 色 而 密 布 棕 褐 色 斑 纹，羽 色 也 较 淡 钝，不 如 雄 鸟 艳 丽。4.3.2 冠 羽 性 状4.3.2.1 冠 羽 颜 色：羽 缘 具 翠 绿 色 宽 缘，中 央 呈 辉 蓝 色。4.3.2.2 冠 羽 形 状：簇 状。4.3.2.3 羽 枝 结 构：羽 轴 两 侧 由 羽 基 至 顶 端 均 着 生 羽 小 枝。4.3.3 颊 部 性 状4.3.3.1 眼 周 裸 皮 呈 浅 钴 蓝 色，颊 部 裸 皮 呈 浅 钴 黄 色。4.3.3.2 眼 先 雄 性 蓝 黑 色，雌 性 棕 褐 色。4.3.4 颈 胸 背 性 状颈 胸 部 及 上 背 部 呈 金 铜 色 的 铜 钱 状 花 斑，羽 基 暗 紫 蓝 色，常 展 露 于 外，羽 缘 闪 翠 绿 色。4.4 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 性 状 差 别绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 整 体 形 态 对 比 参 见 附 录 A 图 A.1。绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 之 冠 羽、颊 部 以 及 颈 胸 背 性 状 对 比见 附 录 A 图 A.2。4.5 疑 似 绿 孔 雀 个 体 形 态 鉴 定将 待 检 个 体 与 纯 种 绿 孔 雀 按 4.3、4.4 条 要 求 进 行 逐 一 观 察、比 对 及 记 录，全 部 性 状 符 合 纯 种 绿 孔 雀形 态 学 特 征，判 定 为 疑 似 绿 孔 雀。5 分 子 鉴 定D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 135.1 鉴 定 材 料经 形 态 鉴 定 为 疑 似 绿 孔 雀 或 无 法 进 行 形 态 鉴 定 的 个 体 的 血 液、羽 毛 样 品 等。5.2 鉴 定 原 理绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀（P a v o c r i s t a t u s）存 在 显 著 的 基 因 组 水 平 遗 传 分 化，可 通 过 计 算 和 统 计 待 检 样 品基 因 组 中 两 物 种 的 遗 传 组 成 贡 献 率 判 断 其 种 质 资 源 状 况。5.3 样 品 采 集5.3.1 样 品 采 集 中 的 动 物 福 利 应 符 合 G B/T 3 5 8 9 2 的 要 求。5.3.2 血 液 采 集 使 用 一 次 性 真 空 采 血 管（添 加 E D T A-K 2）采 血 5 0 L 1 0 0 L。血 样 短 期 保 存 于-2 0 冰 箱，长 期 保 存 于-8 0 冰 箱。5.3.3 血 液 不 可 获 取 时，可 用 无 菌 塑 胶 手 套 收 集 自 然 脱 落 飞 羽、尾 羽 或 尾 上 覆 羽 等。剪 取 如 图 1 所 示的 羽 根 部 分，短 期 保 存 于-2 0 冰 箱，长 期 保 存 于-8 0 冰 箱。图 1 用 于 D N A 提 取 的 羽 毛 部 分 示 意 图5.4 D N A 制 备可 采 用 传 统 D N A 提 取 方 法（参 见 附 录 B 中 B.1）或 商 业 试 剂 盒 提 取 D N A，常 用 试 剂 和 仪 器 参 见 附 录 C，用 于 建 库 的 D N A 宜 符 合 如 下 要 求：a)使 用 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 凝 胶 成 像 系 统（D N A 完 整 性 胶 检 测 见 附 录 B 中 B.2）检 测 D N A 完 整 性，凝 胶 电 泳 条 带 清 晰 且 应 在 2 k b 以 上（如 图 2 示 例）；b)使 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 D N A 纯 度 和 浓 度（检 测 方 法 参 见 附 录 B 中 B.3），在 2 6 0 n m 和 2 8 0 n m的 紫 外 线 吸 收 值 比 值（O D 2 6 0/2 8 0）在 1.8 2.0 之 间，浓 度 不 低 于 5 0 n g/u L，总 质 量 不 低 于 3 g。D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 14图 2 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 D N A 条 带 示 意 图注：其中M 代表D N A 分子量标准M a r k e r，1 6 代表 待检 D N A 样品。图中D N A 主带清晰且在2 K b 以上。5.5 基 因 组 重 测 序开 展 D N A 样 品 的 小 片 段 基 因 组 文 库 构 建（即 建 库）和 测 序，技 术 要 求 应 符 合 G B/T 3 0 9 8 9 的 要 求。选 择 两 端 序 列 对 读（即 双 端 测 序）模 式。上 述 建 库 和 测 序 可 送 至 商 业 公 司 开 展。为 保 证 分 析 质 量，每 待检 个 体 总 测 序 原 始 数 据 量 不 低 于 5 G b p，去 除 接 头 序 列 以 备 后 需 分 析。5.6 参 考 基 因 组 选 择在 N C B I 数 据 库 中 选 择 已 发 布 最 新 版 本 的 纯 种 蓝 孔 雀 基 因 组（如 G e n B a n k 访 问 号：G C A _ 0 0 5 5 1 9 9 7 5.1）和 纯 种 绿 孔 雀 基 因 组（如 G e n B a n k 访 问 号：G C A _ 0 1 6 6 4 7 7 1 5.1）作 为 参 考 基 因 组。5.7 纯 种 鉴 定可 采 用 开 源 软 件 s p p I D e r，分 别 计 算 和 统 计 待 检 个 体 基 因 组 测 序 数 据 中 比 对 到 纯 种 绿 孔 雀 和 蓝 孔 雀参 考 基 因 组 成 分 的 比 例。当 蓝 孔 雀 的 基 因 组 贡 献 率 低 于 1%时，软 件 判 定 待 检 个 体 为 纯 种 绿 孔 雀 个 体。当 蓝 孔 雀 的 基 因 组 贡 献 率 高 于 1%时，软 件 判 定 待 检 个 体 为 非 绿 孔 雀 纯 种 个 体，鉴 定 结 果 模 板 参 见 附 录 D。D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 15附 录 A（资 料 性）蓝 孔 雀 和 绿 孔 雀 性 状 对 比 图图 A.1 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 整 体 形 态 对 比注：引自 D a n i e l G i r a u d E l l i o t,1 8 7 2.A m o n o g r a p h o f t h e P h a s i a n i d a e,o r,F a m i l y o f t h e p h e a s a n t s.图 A.2 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 的 冠 羽、面 部 以 及 颈 胸 背 部 性 状 对 比注：引自 D a n i e l G i r a u d E l l i o t,1 8 7 2.A m o n o g r a p h o f t h e P h a s i a n i d a e,o r,F a m i l y o f t h e p h e a s a n t s.D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 16附 录 B（资 料 性）D N A 样 品 的 提 取 与 检 测B.1 使 用 传 统 方 法 提 取 血 液 或 羽 毛 D N AB.1.1 取 5 L 1 0 L 血 液 或 1 3 个 来 自 同 一 个 体 的 羽 根 于 1.5 m L 离 心 管 中。如 是 羽 根，使 用 灭 过 菌的 眼 科 剪 剪 碎。B.1.2 加 入 5 0 0 L 于 4 预 冷 的 细 胞 裂 解 液（配 方 为：1 0 0 m M T r i s-H C l，5 m M E D T A，5 0 0 m M N a C l，1%S D S，p H 8.0），混 匀 悬 浊 液。B.1.3 向 裂 解 产 物 中 加 入 2 0 L 蛋 白 酶 K 溶 液（1 0 m g/m L），混 匀 后，放 入 恒 温 混 匀 仪 于 1 0 0 0 r p m 混 匀频 率 和 5 5 消 化 3 h 以 上，但 不 要 超 过 1 0 h。B.1.4 将 消 化 液 温 度 降 至 室 温，加 入 2 0 0 L 醋 酸 钾 溶 液 上 下 颠 倒 摇 晃 2 0 s 左 右，使 其 充 分 混 合。B.1.5 放 入 普 通 高 速 离 心 机 中 1 3 0 0 0 r p m 离 心 5 m i n，使 蛋 白/S D S 复 合 物 沉 淀。B.1.6 将 上 清 转 移 到 另 一 干 净 1.5 m L 离 心 管 中，加 入 6 0 0 L 异 丙 醇，充 分 混 合，用 1 3 0 0 0 r p m 离 心5 m i n 收 集 D N A 沉 淀。B.1.7 倒 去 上 清，加 入 5 0 0 L 7 0 乙 醇 溶 液，颠 倒 管 子 数 次，用 1 3 0 0 0 r p m 离 心 3 m i n。B.1.8 倒 去 上 清，在 实 验 台 上 敞 口 放 置 3 m i n 1 0 m i n 促 使 残 余 乙 醇 挥 发。B.1.9 将 D N A 沉 淀 溶 解 于 5 0 L 1 0 0 L 双 蒸 水 中，吸 取 5 L 用 于 琼 脂 糖 凝 胶 检 测 和 核 酸 定 量 检 测，其余 转 入-2 0 保 存。B.2 D N A 完 整 性 胶 检 测B.2.1 用 双 蒸 水 洗 净 制 胶 模 板 和 梳 子，调 节 水 平，放 在 制 胶 平 板 上，向 电 泳 槽 中 倒 入 1 X T A E 电 泳 缓 冲 液，其 量 以 没 过 电 泳 槽 0.2 c m 为 宜。B.2.2 称 取 1 g 琼 脂 糖 与 1 0 0 m L 1 x T A E 缓 冲 液，加 入 到 配 胶 用 的 三 角 烧 瓶 内，旋 转 摇 晃 均 匀。B.2.3 微 波 炉 内 加 热 2.5 m i n，取 出 后 加 入 一 滴 荧 光 染 料，轻 轻 旋 转 以 充 分 混 匀 凝 胶 溶 液。B.2.4 倒 入 胶 槽，加 入 梳 子，室 温 下 放 置 3 0 m i n 至 凝 胶 完 全 凝 结，小 心 向 上 拔 出 梳 子，将 凝 胶 预 浸 在 电泳 槽 内，静 置 2 m i n 至 加 样 孔 内 无 气 泡。B.2.5 使 用 移 液 器 取 1 L D N A 样 品，与 1 L 6 l o a d i n g b u f f e r 混 匀 后，加 入 凝 胶 的 加 样 孔 内。B.2.6 接 通 电 泳 仪 电 源，保 证 加 样 孔 的 一 端 朝 向 负 极，1 5 0 V 恒 压 运 行 2 0 m i n 4 0 m i n，l o a d i n g b u f f er 中 溴 酚 蓝 代 表 的 片 段 大 小 为 3 0 0 b p，电 泳 中 保 证 该 指 示 剂 不 要 泳 动 出 凝 胶。B.2.7 电 泳 完 毕，关 闭 电 源，在 凝 胶 成 像 仪 紫 外 模 式 下 观 察 电 泳 带 及 其 位 置，并 与 D N A 分 子 量 标 准 M a rk e r 比 较 以 判 断 D N A 样 品 的 完 整 性。B.3 D N A 纯 度 和 浓 度 测 量B.3.1 本 文 件 采 用 的 紫 外 分 光 光 度 计 为 N a n o D r o p 2 0 0 0，若 用 其 它 品 牌 和 型 号 的 仪 器，分 析 步 骤 请 参 考具 体 说 明 书。B.3.2 启 动 N a n o D r o p 2 0 0 0 配 套 软 件，设 置 检 测 样 品 为“核 酸”，进 入 检 测 界 面。B.3.3 命 名 样 品 I D，设 置 样 品 类 型 为 D N A，使 用 双 蒸 水 作 为 空 白 液 进 行 基 线 校 准。B.3.4 使 用 滤 纸 擦 净 空 白 液，依 次 检 测 D N A 样 品。D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 17B.3.5 测 量 结 束 后，将 测 量 参 数 输 出 到 表 格，使 用 双 蒸 水 和 滤 纸 清 洁 3 5 次，并 关 闭 软 件。D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 18A A附 录 C（资 料 性）试 剂 及 仪 器 设 备C.1 主 要 试 剂C.1.1 5 0 T A E 缓 冲 液(T r i s-醋 酸 盐-E D T A)：一 种 核 酸 电 泳 缓 冲 液，主 要 用 于 D N A 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳。主 要 成 分 为 T r i s-乙 酸 盐（浓 度 4 0 m M）和 E D T A（浓 度 1 m M）。可 直 接 用 双 蒸 水 稀 释 5 0 倍 至 工 作 浓 度（1）使 用。C.1.2 核 酸 荧 光 染 料：用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带。C.1.3 6 x L o a d i n g B u f f e r：琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 样 缓 冲 液，可 以 显 示 两 条 带，前 面 的 蓝 色 条 带 是 溴 酚 蓝，代 表 的 片 段 大 小 是 3 0 0 b p，后 面 的 绿 色 条 带 是 二 甲 苯 青，代 表 的 片 段 大 小 在 4 0 0 0 b p 左 右。C.1.4 蛋 白 酶 K 溶 液：用 于 核 酸 与 蛋 白 质 的 分 离，浓 度 为 1 0 m g/m L。C.1.5 3 M 醋 酸 钾 溶 液：取 6 0 m L 的 5 m o l/L 醋 酸 钾，加 1 1.5 m L 冰 醋 酸，加 双 蒸 水 稀 释 至 1 0 0 m L，P H 4.8。C.1.6 异 丙 醇：分 析 纯 级。C.1.7 7 0%乙 醇 溶 液。C.1.8 双 蒸 水：d d H2O。C.1.9 琼 脂 糖。C.1.1 0 细 胞 裂 解 缓 冲 液：1 0 0 m M T r i s-H C l，5 m M E D T A 5 0 0 m M N a C l，1%S D S,p H 8.0。C.1.1 1 蛋 白 酶 K。C.1.1 2 S D S：十 二 烷 基 硫 酸 钠。C.1.1 3 D N A 分 子 量 标 准 M a r k e r：1 0 0 b p 2 0 0 0 b p。C.2 仪 器 设 备C.2.1 单 道 可 调 式 移 液 器（如，最 大 量 程 分 别 为 3 L，2 0 L，2 0 0 L，1 0 0 0 L）。C.2.2 恒 温 混 匀 仪。C.2.3 普 通 高 速 离 心 机。C.2.4 电 子 天 平（量 程 0.0 1 m g 1 0 0 0 0 m g）。C.2.5 高 压 灭 菌 器。C.2.6 水 平 电 泳 仪。C.2.7 凝 胶 成 像 系 统。C.2.8 紫 外 分 光 光 度 计。D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 19B附 录 D（资 料 性）鉴 定 结 果 样 表鉴 定 结 果 见 表 D.1。表 D.1 鉴 定 结 果鉴 定 个 体 编 号：_ _ _ _ _ _ _ _；个 体 年 龄 _ _ _ _ _ _ _；个 体 性 别 _ _ _ _ _ _ _；鉴 定 人 _ _ _ _ _ _ _。鉴定方法 鉴定内容结果描述绿孔雀 蓝孔雀 其他形态鉴定（如 未开展，可不填 此项）整体性状雄性 体羽呈金翠绿色 体羽呈蓝色 体羽呈混杂雌性 体羽呈金翠绿色 体羽呈棕褐色 体羽呈混杂冠羽性状 冠羽簇形 冠羽伞状 冠羽性状杂合面部性状雄性眼先呈蓝黑色 眼先呈亮蓝色 混杂眼周裸皮浅钴蓝色 眼周裸皮白色 眼周裸皮杂色颊部裸皮浅钴黄色 颊部裸皮白色 颊部裸皮杂色雌性眼先呈棕褐色 眼先呈锈褐色 混杂眼周裸皮浅钴蓝色 眼周裸皮白色 混杂颊部裸皮浅钴黄色 颊部裸皮白色 混杂颈胸背部性状雄性 呈金铜色铜钱状花斑 呈蓝色丝状 混杂雌性 呈金铜色铜钱状花斑 呈绿色鱼鳞状斑纹 混杂分子鉴定（如 未开展，可不填 此项）基因组 组成 绿孔雀基因组分占比_ _ _ 蓝孔雀基因组分占比_ _ _ 统计结果 显著 不显著 D B 5 3/T 1 0 6 7 2 0 2 11 0表 D.1(续)鉴定方法 鉴定内容 结果描述鉴定结果鉴定个体为：绿孔雀纯种个体非绿孔雀纯种个体_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _DB53/T 1 0 6 7 2 0 2 1