ICS 65.020.30 CCS B 40/49 四川省地方标准 DB51/T 3128 2023 DB51 畜禽遗传 材料收集 与保存技 术规程 2023-12-29 发布 2024-01-29 实施 四 川 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB51/T 3128 2023 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 样 品来 源.2 5 样 品信 息登 记.2 6 采 集人 员要 求.2 7 采 集保 存方 法.2 8 包 装与 运输.3 9 物 流追 踪和 记录.3 10 安 全管 理.3 附录 A（规范 性）畜 禽 遗传材 料样 本信 息采 集单.5 附录 B（规范 性）畜 禽 遗传材 料样 本编 码规 则.6 附录 C（规范 性）畜 禽 样本采 集量 和储 存方 案.7 附录 D（规范 性）猪 冷 冻精液 生产 技术 操作 规程.8 附录 E（规范 性）家 禽 冷冻精 液生 产技 术操 作规 程.11 DB51/T 3128 2023 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标 准化 工作导 则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由四 川省 农业 农村 厅提出、归 口并 解释。本文件 起草 单位：四 川省 畜牧总 站。本文件 主要 起草 人：曹伟，李强，王莉 娟，刘园，张 勇，洪 宁，高 慧纯，王 小强，杨舒 慧，葛 桂华，余易展,刘 政权。本文件 为首 次发 布。DB51/T 3128 2023 1 畜 禽遗传 材料收集 与保存 技术规程 1 范围 本文件 规定 了四 川省 畜禽 遗传材 料收 集、整 理与 保 存相关 的样 品来 源、样 品 信息登 记、采 集人 员要求、采 集方 法、包装 与运 输、安 全管 理、物流 追踪 和记录、样 本信 息管 理。本文件 适用 于四 川省 畜禽 遗传资 源基 因库、保种 场、保护区 等保 种单 位的 畜禽 遗传材 料收 集、整 理与保存。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 2260 中国 人民 共和国 行政区 划代 码 GB/T 5458 液氮 生物 容器 GB 13690 化学 品分 类和 危险性 公示 通则 GB 19489 实验 室 生物安 全通用 要求 GB/T 25172 猪常 温精 液生 产与保 存技 术规 范 GBT 26938 牛体 内胚 胎 生产与 移植 技术 规程 GB 50140 建筑 灭火 器配 置设计 规范 AQ 3013 危险 化学 品从 业 单位安 全标 准化 通用 规范 NY/T 1234 牛冷 冻精 液生 产技术 规程 NY/T 1571 羊胚 胎移 植技 术规程 NY/T 1900 畜禽 细胞 与胚 胎冷冻 保种 技术 规范 NY/T 3186 羊冷 冻精 液生 产技术 规程 NY/T 3444 牦牛 冷冻 精液 生产技 术规 程 NY/T 3458 种鸡 人工 授精 技术规 程 NY/T 3796 马和 驴冷 冻精 液 NY/T 4047 家禽 精液 品质 检测方 法 CNAS-CL05 实验室 生物 安全认 可准 则 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 畜禽遗 传材 料livestock and poultry genetic material 畜禽遗 传资 源的 胚胎、精 液、卵 子、细胞、毛 发、DNA、RNA 等遗 传物 质。3.2 生物安 全 biosafety 国家有 效防 范和 应对 危险 生物因 子及 相关 因素 威胁，生物 技术 能够 稳定 健康 发展，人体 健康 和 生 态DB51/T 3128 2023 2 系统相 对处 于没 有危 险和 不受威 胁的 状态，生 物领 域具备 维护 国家 安全 和持 续发展 的能 力。4 样品来 源 国家 畜禽 遗传 资源 名录 所列 畜禽、蜂、蚕 等遗传 资源。5 样品信 息登 记 5.1 登记 畜禽遗 传材 料样本 信息采 集单，记 录样本 类型、物种信 息、采集地、储存 条件、采 集 人员等信 息。参考 附 录 A。5.2 样品编 号具 有唯 一性，并 且长期 使用，以 保证 信息 的准确 性。样品 编号 由 15 位字符、分 五部 分 组成：4 位 品种 品系 代码 6 位行政 区域 代码（精确 到 区、县）3 位 样品 编号 1 位性 别代 码1 位 样品类型。参考 附 录B。5.3 根据样 本类 型、用途，选 择合适 保存 规格、最 低保 存数量、储 存温 度、储存 类型。参考 附 录 C。6 采集人 员要 求 样品采集 人 员须 接受 专业 培训，熟悉 品种 特性，掌 握遗传 材料 采集 方法、储 存条件 及管 理、防 护 措施等。7 采集保 存方 法 7.1 精液采 集保 存 牛冷冻 精液 采集 和保 存参 照NY/T 1234 的 规定 执行；牦牛 冷冻 精液 采集 和保 存参照NY/T 3444 的规定执行；绵 羊和 山羊 冷冻 精液采 集和 保存 参照NY/T 3186 的 规定 执行；马 和驴 冷冻精 液采 集和 保存 参 照NY/T 3796 的 规定 执行；猪 冷冻精 液采 集和 保存 参照 附录D；家禽 冷冻 精液 采 集和保 存参 照附 录E。7.2 胚胎采 集保 存 牛胚胎采集和保存方法参照GBT 26938 的规定执行；绵羊和山羊胚胎采集和保存方法参 照NY/T 1571的 规定 执行；其 它家 畜胚胎 采集 和保 存方 法参 照NY/T 1900 的规 定执 行。7.3 卵子采 集保 存 家畜卵 子采 集和 保存 方法 参照NY/T 1900 的 规定 执行。7.4 细胞采 集保 存 畜禽体 细胞 的采 集和 保存 方法参 照NY/T 1900 的 规定 执行。7.5 组织样 品采 集保 存 7.5.1 活体采 集保 存 将畜禽 保定 后，利 用取 样器 采集组 织，放 入冻 存管 或锡 箔纸中，做好 样本 标记 迅速 放入液 氮 中 保 存。7.5.2 死亡动 物样 品采 集保 存 DB51/T 3128 2023 3 动物死 后2h 内利 用取 样器 采集组 织，放入 冻存 管或 锡箔纸 中，做好 样本 标记 迅速放 入液 氮中 保存。7.5.3 用于细 胞培 养的 组织 样本 采集 在取样 后3 min 内用PH7.0 的PBS 溶 液对 组织 样本 进 行冲洗、迅 速放 入细 胞保 存 液中，0-4 保存，24h内 进行 细胞 培养。7.6 血液样 品采 集保 存 7.6.1 将畜禽 保定，对采 血部位 外进行 局部消 毒后，用采 血针沿 静脉缓 慢刺 入血管，待血 液流出 后 收集在不 同需 求的 采血 管内，0-4 暂存。7.6.2 需保存 全血 的样 品，全 血0-4 运 输至 保存 单位 后，保存 于-80 冰箱。7.6.3 需保存 血清 的样 品，全 血 0-4 运输 至保 存单 位，进 行血清 分离 并分 装后，保存 于-80 冰 箱。7.6.4 需保存 血浆的 样品，新鲜 全血置 于含肝 素、枸橼酸 钠等抗 凝剂的 试管 中，全 血 0-4运 输 至保存单 位后，进 行血 浆分 离并分 装后，保 存于-80 冰箱。7.7 毛发样 本采 集保 存 畜禽保 定后，对 采集 部位 消毒后，分 别采 集背 部、腹部、颈部、尾部 的毛 发（带毛 囊）放 入冻 存管中，迅 速放 入液 氮进 行储 存。8 包装与 运输 8.1 包装 8.1.1 生物样 本选 用三 层容 器保 存，即 内层 容器、第 二层 容器及 外层 容器。8.1.2 三层容 器包 装上 注明 样本 类型、编号（采 集编 号和 样本编 号）、物 种信 息、日期等 标识。8.1.3 外层容 器须 坚固 耐压，三 层容器 均须 注意 防水、防 漏。8.2 运输 8.2.1 样本的 运输 由专 人承 担，运 输方 式根 据样 本类 型、运输距 离、时间、温 度要 求等条 件决 定。8.2.2 运输前 确认 运输 方式、目 的地、运输 证明 文件 等。运输文 件须 包括 样 本信 息采集 单。8.2.3 恒温（16 18）运 输 的样本，使用 专用 恒温设 备运输。低温（2 8）运输 的样本，使用装 有冰 袋的 泡沫 箱或 其它一 些制 冷剂 保 持 2 8 运输；超 低温（低于-30）条 件运 输的 样本，用干冰 保存 运输；液 氮条 件下保 存的 样本，使 用液 氮罐进 行运 输，符 合 GB/T 5458 的要 求。8.2.4 对于运 输过 程中 可能 出现 的问题，工 作人 员须 提前 准备相 关解 决方 案。9 物流追 踪和 记录 9.1 运输各 个环 节 做 好沟 通、记录、追踪。9.2 装样运 输时核 查是 否达到 各种样 品运送 需要 的防震、恒温 和防照 射等 要求，接样时 核查样 品 是 否符合要 求。10 安全管 理 10.1 基本要 求 DB51/T 3128 2023 4 畜禽遗 传材料 保 存单 位制 定相应 的保 存计 划和 质量 管理、出入 库管 理、安全 管理、消毒 防疫、重 大突发事 件应 急预 案等 制度，以及遗 传材 料制 作、保 存和 质量检 测技 术规 程。有 完整 系统的 技术 档 案 资 料。10.2 消防安 全 畜禽遗 传材料 保 存单 位防 火系统 须符 合 GB 19489 的 规定。畜 禽遗 传资 源保 种 单位灭 火器 的配 置 符合 GB 50140 的 规定。10.3 生物安 全 畜禽遗 传材料 保 存单位 在 样本采 集和 使用 前须 进行 生物安 全评 估。10.4 化学安 全 畜禽遗 传材料 保 存单 位化 学安全 须符 合 GB 13690 的 规定，在 使用 到有 毒有 害 物质的 工作 区域，须符合 AQ 3013 的 规定。10.5 设备安 全 畜禽遗 传材料 保 存单 位的 设施及 仪器 设备 须建 立安 全维护 系统，除 制定 有序 的 设备维 护、更换 计划，定期进 行设 施的 维护 和检 查外，还 须制 定相 关仪 器 设备检 定、校 准计 划并 组 织实施。相关 设施 设备 的 检修工作 都须 由专 业技 术人 员来进 行。10.6 环境安 全 畜禽遗 传材料 保 存单 位放 置干冰、液氮 的地 方要 确 保空气 流通，安装 氧气 与 二氧化 碳检 测装 置。液氮储存 装置须 通过 监控装 备自动 或手动 记录 每天的 液氮 用 量与剩 余量。相关 人员在 操作干 冰和 液氮 时，须做好 防冻 保护 措施 并佩 戴专用 的保 护装 备。10.7 信息安 全 畜禽遗 传材料 保 存单位 须 有统一、完整 的信 息管 理 系统，满 足样 本追 踪、检 索 以及与 其他 数据 系统兼容或 关联 的需 求，须 根 据不同 工作 人员 职责 设置 相应的 权限。信息 管理 系 统须建 立安 全保 障措 施，注意硬件 防潮 及信 息防 盗。A A DB51/T 3128 2023 5 附录A（规范 性）畜禽遗 传材 料样 本信 息采 集单 A.1 畜禽遗 传材 料样 本信 息采 集单 畜禽遗 传材 料样 本信 息采 集单见 表A.1。表A.1 畜 禽遗 传材 料样 本信息 采集 单 采集编号 样本类型 血液 组织 细胞 精液 胚胎 卵子 毛发 其他 物种信息 属 种 亚种 性别 繁殖方式 采集地 省/直辖市 市 县/区 具体地点 储存条件 4 冰箱-20 冰箱-80 冰箱 液氮 其他 采集人员 姓名 单位 日期 DB51/T 3128 2023 6 附录B（规范 性）畜禽遗 传材 料样 本编 码规 则 B.1 畜禽遗 传材 料样 本编 码规 则 畜禽遗 传材 料样 本编 码规 则见表B.1。表B.1 畜 禽遗 传材 料样 本编码 规则 品种品系编码 行政区域代码 分管号 性别 类型 001-NNN F-雌性 D-DNA 001-NNN M-雄性 R-RNA 001-NNN C-细胞 001-NNN T-组织 001-NNN B-血液 001-NNN E-卵子 001-NNN EM-胚胎 001-NNN S-精子 001-NNN H-毛发 示例：CH0151XXXX001FB CH01：成华猪 51XXXX：四川 省 XX 市 XX 区 001：第一管样本 F：雌性（Female）B：血液（Blood）CH0151XXXX001FB 即成华猪在四川省 XX 市 XX 区采集的雌性第一管血液样本 DB51/T 3128 2023 7 附录C（规范 性）畜禽样 本采 集量 和储 存方 案 C.1 畜禽样 本采 集量 和储 存方 案 畜禽样 本采 集量 和储 存方 案见表C.1。表C.1 畜 禽样 本采 集量 和储存 方案 样本类型 保存规格 最低数量 储存条件 用途 血液 3-5 mL 3 管-80 冰箱 RNA/DNA/蛋白提取 组织 2-10 g 3 管-80 冰箱 RNA/DNA/蛋白提取 3 份 液氮 RNA/DNA/蛋白提取/建立细胞系 胚胎 单胎：1 枚 多胎：2 枚 200 份 液氮 动物扩繁、育种 卵子 单胎：1 枚 多胎：2 枚 200 份 液氮 动物扩繁、育种 精液 0.25 mL 猪：15000 管 牛：3000 管 羊：3000 管 液氮 动物授精、扩繁和育种 毛发 适量 3 管-80 冰箱 核 DNA 和线粒体DNA 分析 DB51/T 3128 2023 8 附录D（规范 性）猪冷冻 精液 生产 技术 操作 规程 D.1 采精前 准备 D.1.1 种 公猪 D.1.1.1 种公 猪体 型外 貌 和生产 性能 符合 本品 种标 准，体 质健 康，系谱 齐全。D.1.1.2 采精 前先 修剪 种 公猪阴 毛 至 2cm 以下，刷 拭公猪 体表 并清 洗消 毒。D.1.2 采 精室 D.1.2.1 检查 假台 猪是 否 平稳，擦拭 假台 猪后 半部。D.1.2.2 检查 假台 猪后 方 的防滑 垫，防止 公猪 爬跨 时打滑。D.1.2.3 对采 精室 清洗，并用紫 外线 消毒。D.1.2.4 采精 室的 温度 须 控制在 15 25。D.2 采精 采精操 作按 照 GB/T 25172 的规定 进行。D.3 鲜精品 质检 测 D.3.1 检 测方 法 检测方 法 按 GB/T 25172 的 规定进 行，并做 好登 记。D.3.2 质 量要 求 D.3.2.1 外观 淡乳白 色或 灰白 色，均匀 一致，无杂 质。D.3.2.2 气味 略带腥 味，无异 味。D.3.2.3 精子 活力 精子活 力70%。D.3.2.4 精子 密度 精子密 度1108个/mL。D.3.2.5 精子 畸形 率 精子畸 形率15%。D.4 鲜精处 理 D.4.1 预 稀释 营养液(葡萄 糖 1.5g、乳 糖 3g、甘氨 酸 0.8g，蒸 馏 水 100mL)先预热到 32，与 鲜精 1：1 混 合均 匀。预稀释 后的 精液 放 入 17 恒温箱 内。D.4.2 离心 将预稀 释精 液装 入 100mL 500mL 的离心管或 离心 杯内，在 17和重力 800g 条件 下离 心 15minDB51/T 3128 2023 9 后，弃 上清 液。D.4.3 稀释 冷冻稀 释液(葡萄 糖 6.12g、EDTA 0.3g、蒸 馏水 75mL、蛋黄 20mL、甘油 5mL、乙二 醇 0.83mL、青霉素 和链 霉素 各 1 105 U)预热至 17，以 精子 密度 不低 于 4 108个/mL 计算冷冻稀 释液 添加 量。先 取2/3 冷冻 稀释 液加 到离 心管 中，以 吸吐 方式 混合 均匀，装入 专用 器皿 中，再用 剩余冷 冻稀 释液 冲洗 离心管壁后 合并。D.4.4 平衡 将盛放 精液 的器 皿放 入 17 水浴 杯中，一 同放 进 4 冰箱，平 衡 1.5h。D.4.5 分装 D.4.5.1 将精 液分 装到 0.25mL 或 0.5mL 细管中，标明 生产 单位、品 种、种公猪 号和 生产 日期。D.4.5.2 剔除 有气 泡、未 灌满等 不合 格的 细管 精液。D.4.5.3 将分 装好 的细 管 精液铺 放在 冷冻 支架 上。D.5 冷冻 D.5.1 冷 冻方 式 D.5.5.1 程序 冷冻：程控 冷冻仪 的冷 冻柜 预冷 至 4，将细 管放 入冷 冻柜。以 2/min 的速 率，从 4下降 至 1，以 30/min 的速率，从 1 下降 至-25，以 30/min 的速率从-25下降 至-140，-140保持 15min。冷冻程 序完 成后将 细管 浸入 液氮。D.5.5.2 熏蒸 冷冻：将 液 氮倒入 深度 50cm 以 上的 专用冷 冻箱 预冷 10min，保持冷 冻支 架高 于液 氮 面 2cm、熏蒸冷 冻 8min。D.5.2 包装 将冷冻 好的 细管 精液 包装 好，外 包装 上标 明生 产单 位、品 种、种公 猪号、生 产日期 和支 数等。D.5.3 保存 将包装 好的 细管 精液 放置 液氮中 保存。D.6 解冻 解冻液（葡 萄糖 3.7g、无 水柠檬 酸 钠 0.6g、碳 酸氢 钠 0.125g、EDTA 0.125g、氯化 钾 0.075g，蒸馏水 100mL。)预热至 26。从液氮 罐中 快速 取出 2 支3 支 细管 精液，放至 38 水浴锅 中 15s 20s 或 50 水浴 锅中 7s 解 冻。剪开细 管精 液封 口端，挤 入数滴 精液 至 1mL 解冻液中，搅 匀，回温 到 37，静置 20min。D.7 冻精品 质检 测 D.7.1 检 测方 法 检测方 法 按 GB/T 25172 的 规定进 行，并做 好登 记。D.7.2 质 量要 求 D.7.2.1 精子 活力 DB51/T 3128 2023 10 精子活 力30%。D.7.2.2 精子 密度 精子密 度4108个/mL。D.7.2.3 精子 畸形 率 精子畸 形率18%。D.7.2.4 细菌 菌落 数 细菌菌 落数800CFU/mL。D.8 生产记 录 做好冷 冻精 液生 产全 流程 记录并 存档。DB51/T 3128 2023 11 附录E（规范 性）家禽冷 冻精 液生 产技 术操 作规程 E.1 采精前 准备 E.1.1 种 公禽 E.1.1.1 选择 符合 本 品 种 标准，体 质健 康，系 谱齐 全 的成 年种 公禽，单笼 饲 养3-4周，准备 后续 采精 训练。E.1.1.2 配种 前1-2 周开 始采精 训练，每 天训 练1 次，使公 禽形 成条 件反 射，训练可 采取 按摩 法。E.1.1.3 正式 采精 前，需 剪掉公 禽泄 殖腔 周围 直径5-7cm 范围内的 羽毛，并 在3h-4h内不再 喂水 喂料。E.1.2 采精 用具 参考NY/T 3458 执 行。E.1.3 采精 室 E.1.3.1 采精 环境 保持 清 洁无污 染。E.1.3.2 环境 温度 保持 在20-25。E.2 采精 采精员 右手 手指 夹住 集精 管（管 口朝 手背 侧），掌 心贴近 公禽 腹部，并 快速 抖动，左手 掌掌 心 向 下贴于公 禽背 部，从翼 根向 背腰部 由轻 渐重 推至 尾羽 区，按 摩数 次，待公 禽尾 部翘起 泄殖 腔外 翻，右 手 顺势将尾 部向 背部 提起，用 拇指和 食指 在泄 殖腔 外侧 适当挤 压。公禽 排精 时，翻转左 手背，使 集 精 管 口 向上接取 精液。E.3 鲜精品 质检 测 E.3.1 检 测方 法 参考NY/T 4047 执 行。E.3.2 质 量要 求 E.3.2.1 外观 乳白色 不透 明液 体，整体 均一。E.3.2.2 精子 密度 精子密 度10108个/mL。E.3.2.3 精子 活力 精子活 力65%。E.4 鲜精处 理 E.4.1 稀释 稀释液（谷氨 酸钠1.52g、柠檬酸 三钾0.128g、乙 酸镁0.08g、葡萄 糖0.6g、1M 氢 氧化钠5.6mL、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸3.05g、pH7.1、蒸 馏水100mL）预热后与精 液1：1混 合。DB51/T 3128 2023 12 E.4.2 平衡 稀释后 的精 液放 于2-5 平衡，同时 冷冻 液（稀释 液加终 浓度10%-12%的 甘 油）放 置在 同样 条件下预冷，平 衡15min。之 后 将冷冻 液与 精液 混合，2-5 平衡10min。E.4.3 分装 E.4.3.1 将精 液分 装到 0.25mL 或 0.5mL 细管中，标明 生产 单位、品 种、种禽号 和生 产日 期。E.4.3.2 剔除 有气 泡、未 灌满等 不合 格的 细管 精液。E.4.3.3 将分 装好 的细 管 精液铺 放在 冷冻 支架 上。E.4.4 冷冻 E.4.4.1 液氮 熏蒸 法 将液氮 倒入 深度50cm 以 上的专 用冷 冻箱 预冷10min，保持 冷冻 支架 高于 液氮 面2-6cm、熏蒸冷冻2-5min。E.4.4.2 程序 冷冻 法 程控冷 冻仪 的冷 冻柜 预冷 至4，将 细管 放入 冷冻 柜。以 7/min 的速率，从4 下降 至-35，以60/min 的速率，从-35 下降至-140，-140 保持15min。冷冻 程序 完成 后 将细管 浸入 液氮。E.4.5 包装 将冷冻 好的 细管 精液 包装 好，外 包装 上标 明生 产单 位、品 种、种禽 号、生产 日期和 支数 等。E.4.6 保存 将包装 好的 细管 精液 放置 液氮中 保存。E.4.7 解冻 细管从 液氮 中取 出，浸入 在2-4 的 冰水 浴中1-2min 解冻。E.5 冻精品 质检 测 E.5.1 检 测方 法 参考NY/T 4047 执 行。E.5.2 质 量要 求 E.5.2.1 精子 密度 精子密 度8108个/mL。E.5.2.2 精子 活力 精子活 力40%。E.6 生产记 录 做好冷 冻精 液生 产全 流程 记录并 存档。